Corso di Laurea in Scienze e tecnologie agrarie - STA

Analisi genomica applicata

Anno accademico 2007/2008

Sommario insegnamento

• Obiettivi formativi
• Programma
• Testi consigliati e bibliografia
• Note
• Strumenti didattici

Obiettivi formativi

Programma

Lezioni teoriche

-         Progetti genoma e obiettivi comuni ai progetti

-         Mappe genetiche, mappe fisiche e citologiche. Tecnica FISH

-         Sequenziamento DNA: metodo Sanger

-         Altre tecniche di sequenziamento: pirosequenziamento, sequenziamento tramite ibridazione, spettrofotometria di massa, visualizzazione diretta tramite atomic force microscopy, sequenziamento tramite nanoporo

-         Librerie genomiche e librerie a cDNA

-         Vettori di clonaggio: plasmidi, batteriofagi, cosmidi, PAC, BAC, YAC

-         Sequenziamento del genoma: metodo gerarchico, metodo shotgun

-         Progetti genoma nelle piante

Richiami sulla tecnica AFLP (amplified fragment length polymorphism):

- Protocollo AFLP: preparazione del DNA stampo, amplificazione e analisi degli amplificati;

-   principi del metodo, qualità del DNA, dimensione dei genomi analizzabili, restrizione e ligazione contemporanea, ottimizzazione delle condizioni di amplificazione, utilità dell’utilizzo contemporaneo di due enzimi di restrizione;

-   applicazione della tecnica per il fingerprinting di genomi semplici, valutazione del numero di frammenti attesi;

-   applicazione della tecnica per il fingerprinting di genomi complessi, utilità dell’introduzione della fase di pre.amplificazione

-   polimorfismi rilevabili

-   sistemi di analisi degli amplificati, utilizzo di marcatura radioattiva, marcatura fluorescente o mediante digossigenina, utilizzo di primer non marcati e colorazione mediante tecnica silver staining

Tecniche AFLP derivate:

- SAMPL (selective amplification of polymorphic loci) ed M-AFLP (microsatellite-AFLP): principi dei metodi, utilizzo di primer dotati di sequenze ripetute per l’isolamento di sequenze microsatellite,  principali applicazioni in campo vegetale;

Esercitazioni pratiche

1) Applicazione della tecnica AFLP in specie ortive:

- definizione del protocollo 

- restrizione e ligazione del DNA genomico

- preamplificazione  e controllo degli amplificati su gel di agarosio

- amplificazione mediante l’utilizzo di primer caratterizzati da un diverso numero di nucleotidi selettivi e controllo degli amplificati su agarosio

- analisi degli amplificati su gel di poliacrilammide (gel casting e corsa elettroforetica)

- colorazione del gel mediante silver staining;

- analisi dei profili elettroforetici ottenuti

2) Applicazione della tecnica Microsatellite-AFLP per l’isolamento di frammenti contenenti sequenze microsatellite:

- amplificazione selettiva mediante l’utilizzo di primer AFLP in combinazione con primer ISSR,

- corsa su gel di poliacrilammide e colorazione mediante silver staining

- Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van Der Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Resources 23 (21), 4407-4414.
-‘Introduzione alla genomica’ G. Gibson, S.V. Muse. Ed. Zanichelli
-‘Genetica e genomica’ G. Barcaccia, M. Falcinelli vol.3. Ed. Liguori

Note

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